5月份会议：5月28日·杭州-生物发酵分离提取研讨班

一、摇瓶培养的特点

摇瓶之所以被广泛使用，原因有几个：

高通量：比搅拌罐反应器更适合 同步进行多组实验；

操作简单：无需复杂设备；

成本低：材料和工时消耗少；

灵活性高：适用于多种细胞类型。

剪切力低：摇瓶中的剪切力更低，更适合对剪切敏感的细胞。

但也正因为太常见，很多研究人员忽略了其中的物理机制，导致实验结果不稳定、重复性差，甚至影响后续放大生产。

二、常见陷阱与实用建议

1. 摇瓶参数记录不全及参数的合理范围

许多研究者在摇瓶实验中仅关注并报告摇频（n），却忽略了同样关键的摇径（d₀）、瓶最大内径（d）和装液量（V_L）。摇瓶中的氧传递容量（OTRmax）、功率输入（P/V）以及同相/异相行为（Ph）均由这四个参数共同决定，只记录摇频而缺失其他参数会导致他人无法准确复现实验，也使得工艺放大后出现意想不到的偏差。正确的做法是完整记录四项参数，并在发表时一并报告。

2. 瓶塞选择不当：无形的氧限制

铝箔、Parafilm（封口膜）或密实棉塞常被用于封口，但这些材料的透气性极低，研究表明铝箔和Parafilm的氧传递系数仅为棉塞的1/10以下，导致摇瓶内氧气供应不足而细胞生长缓慢，研究者却往往误以为是菌株或培养基的问题。铝制瓶盖还可能因对流增加污染风险。正确的选择是使用棉塞或专用透气硅胶塞，并可采用CO₂半衰期等方法对瓶塞通风能力进行定量评价。

3. 盲目使用挡板瓶：重现性的噩梦

挡板瓶虽然被设计用来提升氧传递效率，但其实际表现高度依赖具体的几何特征。不同厂家、不同型号的挡板在数量、深度和形状上差异明显，导致功率输入和流体动力学行为难以统一描述。更为棘手的是，当摇频或摇径不足以克服挡板带来的额外阻力时，液体极易进入“异相”状态，此时液体运动与摇瓶运动脱节，混合和氧传递效率急剧下降。此外，挡板或内部传感器贴片还可能成为泡沫的诱发源，使最大氧传递速率（OTRmax）出现高达3倍的波动，同时挡板的存在还会增加无菌塞被润湿的风险，从而引入污染隐患。因此，挡板瓶并非普遍意义上的“更好”，在绝大多数情况下应避免使用。只有在明确掌握其具体几何参数、并能通过工艺条件确保其始终处于“同相”运行状态时，使用挡板瓶才可能带来正向收益。

4. 忽略氧供应评估：细胞在“窒息”中生长

许多文献中缺失摇频、装液量等关键参数，或参数设置导致最大氧传递容量（OTRmax）远低于细胞的实际摄氧率。基于343组实验建立的关联式显示，在常见条件（250 mL瓶、50 mL装液、250 rpm）下OTRmax仅为10–15 mmol/L/h，而许多好氧菌的摄氧率可达30–50 mmol/L/h。不计算OTRmax就盲目开展实验，会使细胞在不知不觉中处于缺氧状态，导致筛选结果失真，放大后工艺失败。实验前应使用Meier公式或在线计算器评估OTRmax，并通过提高摇频、减少装液量、增大摇径来保证充足氧供应。

同相：液体与摇瓶运动同步，混合均匀，氧传递良好；

异相：液体运动滞后，导致混合不均、氧传递受限。

摇瓶条件下的氧传递水平及提高供氧水平的方法

5. 忽视同相/异相现象：传质的“黑天鹅”

尽管Büchs等早在2001年就提出了这一现象，但至今仅有0.24%的摇瓶相关文献提及“out‑of‑phase”一词，说明绝大多数研究者对此毫无概念。在实际实验中，若未评估相位数（Ph）和轴向弗劳德数（Fra），可能无意中将培养置于异相状态，导致氧限制、混合不足、功率输入降低等一系列问题。更严重的是，异相条件下筛选出的“优胜菌株”往往只是更耐受低氧和恶劣混合环境的次优菌，而非真正的高产菌；当工艺放大到搅拌罐（不存在异相）时，这些菌株的表现会大幅下滑，造成放大失败。此外，培养过程中粘度升高（如丝状菌、产聚合物体系）会进一步加剧异相风险，即使初始条件正常也可能中途进入异相。因此，不计算相位数、不评估异相风险，是摇瓶筛选中一个隐蔽但极具破坏力的误区。

6.泡沫问题长期被忽视，破坏实验重现性

非挡板摇瓶通常被认为不会发泡，但研究表明在特定条件下（如异相状态、内部有传感器贴片或挡板）泡沫可大量形成。泡沫能使OTRmax异常提高三倍，显著改变工艺条件，且泡沫与非泡沫培养的结果无法直接比较，严重破坏实验重现性。传感器贴片即使很小也能诱导泡沫，异相状态下更易发泡。实验记录中必须注明是否发泡，并尽量避免诱发因素，同时应注意泡沫对光学法生物量监测的干扰。

7.忽略有效剪切率在摇瓶与搅拌罐间的巨大差异

许多研究者按功率输入从摇瓶直接放大到搅拌罐，却发现细胞形态或产物合成异常。Giese等（2014）首次系统测定了摇瓶中的有效剪切率，发现在相同体积功率输入下，摇瓶的有效剪切率是搅拌罐的至少1.55倍，导致摇瓶中的表观粘度比搅拌罐低50%。这意味着直接按功率放大时，细胞在搅拌罐中实际承受的剪切环境与摇瓶完全不同。放大策略必须同时考虑功率输入和有效剪切率的匹配，而非仅看平均值。

8.混淆平均功率输入与最大功率输入

长期以来，研究者往往默认摇瓶的功率输入远低于搅拌罐，或只关注平均体积功率输入，认为只要平均值相当两尺度就等效。然而，对于大多数处于层流状态的摇瓶培养，平均功率输入等于最大功率输入，且最大功率输入仅取决于摇频和瓶径；而在搅拌罐中，最大功率输入显著更大。最大功率输入直接决定水力剪切应力，对于丝状菌、哺乳动物细胞等剪切敏感细胞，这一差异会导致放大后细胞损伤、形态改变或产物表达下降。因此必须同时评估平均和最大功率输入。

***需要注意的时，第7个误区是和粘度和混合程度相关的，在等效输入功率的情况下，发酵罐平均剪切力是偏低的，这导致了其物质传递较低。第8个误区是定外在输入功率不同分布的情况下导致的，比如由于桨叶类型，桨叶不同位置线速度的不同，导致的不同位置的功率不同，最大功率处的剪切力非常高，这会导致细胞死亡。

9.忽视在线监测，仅依赖终点取样与初始条件设定

许多摇瓶实验仍停留在“设置初始pH并加缓冲液、培养结束后测一次产物”的传统模式，没有引入OTR、pH及生物量的在线监测。OTR数据不仅能判断氧限制，还能实时反映营养缺乏（氮、磷耗尽）、复杂原料（酵母浸粉）的批次质量差异以及底物生物利用度变化；更重要的是，当葡萄糖等碳源耗尽时，许多菌株会迅速降解目标产物（如苹果酸、胞内油脂、赖氨酸、酶蛋白等），仅在终点取样会误判菌株优劣。pH值在过程中可能漂移，仅靠初始缓冲不足以维持稳定。生物量光学监测（散射光）易受泡沫、不溶底物和细胞形态的干扰，不能盲目采信。引入OTR、pH和生物量的在线监测，并批判性地解读数据，是避免该误区的关键。

10.消泡剂与微颗粒添加不当，产生双刃剑效应。

为抑制泡沫或调控剪切力，研究者常随意添加消泡剂或微颗粒，却忽略了它们复杂的生物物理效应。Routledge等（2011）发现不同消泡剂作用机制迥异：有的通过提高培养密度增加总产量（如P2000、SB2121），有的通过提高比产量（每细胞分泌量）增加总产量（如Antifoam A、C、J673A），且对kLa和溶氧无显著相关，提示消泡剂可能影响细胞膜通透性或蛋白分泌途径。Schrader等（2023）在摇瓶中加入微颗粒调控丝状菌剪切应力，定义了“应力面积比（SAR）”，但颗粒会改变流体力学、可能诱发异相或污染。消泡剂和微颗粒的添加应在充分优化种类和浓度的基础上进行，并记录其对产量、密度、分泌及过程稳定性的影响。