发酵产品开发及生产工艺优化思路

看到一个非常不错的帖子，是关于怎么样研发一个发酵工艺的，原文是采取访谈试的内容展开的，在这里，将内容进行了整理，以便更好的理解，有些地方加入了一些自己的理解，供大家学习和交流。

 一、生产菌株性能开发S曲线

首先来说一下菌株性能曲线，我感觉这个描述为菌株开发曲线，更加确切，是在描述开发一个有价值的生产菌株产生的三个阶段：第一阶段，零到毫克级别，从无到有的阶段；第二阶段，毫克级别到公斤级别，提高生产性能的阶段；第三阶段，公斤级别到商品，产业化的阶段。可以看出这个S型曲线，是从一个概念到一个成熟产品的过程。该曲线呈现S型，其中第一个阶段和第三个阶段对菌株生产性能的提升并不是很明显，但是却也是必须的，第二个阶段是提升菌株性能最快的一个阶段。

二、第一阶段

第一阶段，从“零”到“有”的阶段，所谓有是指的有价值，有初始生产能力的菌株，是我们从一个想法到一个具有一定表达能力的菌株。至于从想法到具有初步表达能力的菌株所采取的方法非常多，这里不一一叙述了。这个菌株是否有价值，我们需要经过多方面的考证，包括产品的市场和价值，安全性，菌株生产成本，菌株提升空间等，也有很多是在开展这个项目的时候就需要考虑清楚的，以避免后期返工，甚至直接面临终止的命运。

因此我们需要建立一个模型，或者建立一个可行性评估的方法。

“这一切都是从商业机会和技术经济分析开始的。在进入实验室做任何实验之前，重要的是要确定这种分子有市场，并对生产经济学、菌株和工艺性能目标有初步了解”。可行性分析的出发点就是能不能有经济效益，这也是非常好理解的，我们在做科研立项时，首先要考虑的就是立项背景和意义。

“我们利用细胞代谢模型、发酵工艺参数和预设计的提取纯化工艺步骤，来定期进行产品的技术经济分析。这一分析可以说明一种产品是否具有商业可行性，即是否可以以低于预期价值的价格生产。它还可以帮助提供几个发酵参数，例如: 使用什么碳源，生产需要多大通风量，在低 pH 值或中性 pH 值下运行是否有益，以及使用哪种类型微生物”。如果你想做的这个产品非常有市场，但是他的生产成本注定非常高，或者说现阶段是不可能改变的，那你就要考虑放弃，或者选择别的方案。技术可行性最终决定经济可行性。

“该模型还提供了一个评估菌株和工艺性能的框架，从而能够在研发过程中设置项目中的节点。早期的技术经济模型需要做出许多假设，但是随着菌株和工艺开发的推进，人们可以验证或修改这些假设来进一步完善模型”。在项目立项时，我们会根据需求（经济和市场）对菌株和工艺做很多的假设，比如耐酸性的假设，比如生产成本的假设，这些假设并不是都能达成的，而往往是相互弥补性的实现的，比如说可能生产成本没有能够达到希望，但是生产水平却超过了预期。

发酵专业和知识对第一个阶段的重要性

如果说“发酵专业知识对发酵工艺的改进是非常重要的”是非常好理解的。但如果说发酵专业知识对第一阶段非常重要，却不是很好理解。

①需要发酵知识，以建立可行的技术经济模型。

②发酵知识对最开始工程菌的构建同样重要。例如，了解在大规模发酵中使用抗生素和昂贵的诱导剂是否可行，有助于尽早确定使用什么表达系统，以及是否使用质粒或将基因整合到基因组中。从一开始就要坚持目标导向，这样可以避免返工，并加快总体时间进度。

③对最终发酵工艺的预判有助于开发高通量的菌株筛选系统，以筛选出合适的菌株。

在 96 孔板的菌株筛选模式中模拟发酵条件，将确保你选择到在发酵条件下表现良好的菌株，因为你筛到的就是想要得到的。在进行高通量菌株筛选时，如果忽视了发酵工艺，可能会错误地选上在生物反应器中表现不算好的菌株，而遗漏那些实际上最好的菌株。

这就是为什么早期在团队中有一些发酵专家是有好处的，因为他们可以从经验中了解发酵工艺的大致情况。根据对有关生物和产物的了解，以及技术经济模型的最佳条件，他们至少可以预测工艺参数最终将落在何处的大致范围。例如，如果所设想的发酵工艺是在 pH 值 3 和 30℃ 下，使用特定培养基成分的需氧、批次补料工艺，那么从一开始就应该尝试在微孔板测定中模拟这一过程。

④在生物反应器中对野生型菌株做一些简单验证型的工作也可以帮你了解其生长特性，如最佳 pH 值、生长速率、生物量产率、营养需求以及对过量底物或溶氧受限时的代谢反应。基于这些信息，你可以为你的培养基着手开发一个简单的补料方案和培养基营养成分方案，并将这些信息与 96 孔板筛工作流程的开发结合起来。当我们研究大肠杆菌或酿酒酵母时，这些都是已知的，这个过程会非常简单。然而，当研究一种较为特别的微生物时，尽早了解新陈代谢和生理参数是一项至关重要的工作。

⑤最后，产物毒性也应尽早评估，甚至在开始设计菌株之前。候选宿主细胞的野生型如何耐受高浓度的产物？可以在微孔板或烧瓶中进行评估，然后在生物反应器中进行确认。在 Zymergen，我们经常通过评估多个宿主的产物耐受性，来选择一个优质的宿主。

所有这些工作都是「阶段 0」的一部分：确保选择对产物有耐受性的宿主，确保这些宿主可以在生物反应器中按照设想的发酵工艺生长，确保微孔板试验能够反映发酵工艺条件。这种工作可以避免走错路，避免在切换宿主和工艺条件的过程中大量返工。

好菌株要配合适的工艺：要接受一个更动态的观点，以看待工艺开发和菌株筛选之间的相互作用。工艺开发和菌株筛选常被看做是线性的或有先后顺序之分的，在这种情况下，只有在通过菌株工程化达到某个滴度节点时，工艺开发才开始。一项生物制造工艺的开发是不断迭代且非线性的；最终表现最佳且具备可放大性的生产工艺一定是最好的菌株配合最好的工艺，二者是相互依赖的，因此需要协同开发。

三、第二阶段

第二阶段，生产性能提高阶段，能够实现从毫克级别到公斤级别的变化。是工艺优化的过程，包括：代谢通路优化，发酵工艺优化，发酵培养基优化，逐级放大等。

3.1我们可以优化什么

第一个阶段我们通过各种手段获得了具有初步表达能力的菌株，也通过模型分析证明了该菌株具有较大的经济效益。那么第二个阶段就是为了提高该菌株的生产能力，实现初步的中试生产。为了实现这个目的我们可以从以下方面进行开展工作：

①发酵培养基优化，发酵培养基为微生物生长和表达产品提供营养物质，我们需要寻找能够高效的，廉价的培养基配方。

②发酵条件优化，pH，温度，溶氧，转速等条件直接影响微生物的生长和表达，需要一一优化。

③补料方式优化，很多情况下我们会涉及到补料，那么就需要优化补料培养基和补料策略。

④代谢和分子水平优化，并不是说该阶段就不需要分子手段上的优化了，结合其他方面优化反馈回来的问题，我们可以采用分子手段进行改造，以提高其生产效率。比如，我们可以通过代谢通路优化，接触某种物质对产物表达的抑制，也可以切断某种物质的通路，使其更多的流向目标产物。

    3.2所用到的发酵设备

（1）       微孔板菌株筛选工艺流程：我们通常会构建大量菌株，远多于在生物反应器中测试的数量，这个菌株数就算我们用摇瓶也是测试不过来的，因此我们总是先在微孔板上测试，然后将最有希望的菌株推广到生物反应器上。通常，90% 以上的菌株都无法进入生物反应器培养阶段，所以我们需要确保 96 孔板能够预测菌株在生物反应器中的性能。

采用微孔板进行的实验优化时，要不断的将建立微孔板和大型反应器之间的关系，这需要很多数据支撑，以减少两者之间的脱节。

例如，由于不能控制 pH 值，不能进行可控的底物或营养物补料，微孔板在氧传递速率方面受到限制。另一方面，微孔板筛选也不是完全可预测；它只是需要有一个足够好的模型来捕捉改良后的菌株。因此，持续监控微孔板与生物反应器之间的相关性并改善微孔板筛选 (如果其预测能力出现偏差) 至关重要，尤其是在发酵工艺正在改进时。

随着科学技术的发展，微孔板培养也有了成套的技术，并且可以精确补料，详细可见文档：微型微生物发酵培养中的补料方法

（2）       摇瓶：摇瓶优化是我们最常用的小规模优化方法，也是非常成熟的优化方法。在摇瓶条件下，我们可以对培养基，培养条件等进行详细的优化，比如，碳源、氮源、温度、pH、转速等。通过摇瓶条件我们一般会获得初始的发酵工艺，为后续的放大提供技术基础。

（3）       小试发酵罐：我们通常已经使用野生型菌株做了一些早期的工艺开发工作，以获得基本的生理参数。然后，一旦我们产生了一个具有一定产量水平的菌株，我们就可以通过改变补料方案、养分可用性、pH 值、温度等来优化发酵工艺。当你只能生产微克或毫克每升时，启动工艺开发工作不是很有用，因为在这一时点上代谢通路的流量仍然非常有限。但是假如菌株性能改良的速度非常快，那工艺开发的时间也不能太晚。

3.3用什么样的方法-实验设计

这些初始发酵实验通常从工艺参数的单因素测试开始，以确定最敏感的参数和适当的范围。然后进行多变量实验设计 (DoE) 研究，以找到这些参数的最佳组合。这些生物反应器实验的结果应该反馈到菌株工程化的工作中: 如果在发酵过程中发现了一种中间产物或副产物，菌株工程师就可以相应地优化路径。因此，来自生物反应器的发酵数据有助于确定基因编辑的优先级。

这些初始发酵实验通常从工艺参数的单因素测试开始，以确定最敏感的参数和适当的范围。然后进行多变量实验设计 (DoE) 研究，以找到这些参数的最佳组合。这些生物反应器实验的结果应该反馈到菌株工程化的工作中: 如果在发酵过程中发现了一种中间产物或副产物，菌株工程师就可以相应地优化路径。因此，来自生物反应器的发酵数据有助于确定基因编辑的优先级。

具体实验设计及介绍请查阅：发酵工艺建立常用实验设计和方法。

4.       第三阶段

4.1什么时候开始，解决什么问题

这取决于项目里程碑，并在时间和预算方面考虑最终目标。最初，你可能只需要扩展到一个中试设备，以产出一些材料或用于行政审批，或用于客户测试，或给下游团队继续开发。如果是这样的话，知道需要多少材料就意味着需要多少工艺开发工作来达到这些目标。当生产规模放大到商业化生产时，需要执行更多的工艺开发工作，以提高生产经济性，并能了解工艺如何应对可能在更大规模量产时发生的干扰。

该阶段需要解决的问题：①进一步优化工艺，达到或者超过实验水平②核算成本③解决后处理、分离提取等工艺问题。④提高菌株的稳定性和鲁棒性。

4.2大型设备和实验性发酵罐的区别

工艺放大不是小事，因为工业发酵罐在几个关键方面不同于小试发酵罐。但是，记住这些差异可以帮助避免一些工艺放大时会遇到的的挑战。

首先，大型反应器的供养条件可能低于小发酵罐。因此，当开发一个小试工艺时，重要的是将底物补料速率和氧气消耗速率 (OUR) 控制在与工业相关的范围内，以确保工艺的可放大性。

其次，大型反应器比小试反应器更不均衡。大型反应器具有有压力和气体浓度梯度，且混合时间更长。在小试规模，你可以模拟其中的一些因素，研究这些生物是如何对这些波动做出反应的。理想情况下，选择或培育出的细胞对波动不敏感，并且在复杂环境中表现相似。

第三，接种大型发酵罐的多级种子罐通常比小试工艺要多出若干培养级数，进而导致菌株从冻存管到发酵生产过程经历更多次扩增次数。这可能会导致小试培养和大规模培养表现差异巨大，尤其是生产菌株遗传不稳定的时候，这种差异更加显著。遗传不稳定菌株在小试水平可能经历 30 代传代依然表现良好，但是在大规模反应器中，由于种子传代次数更多，在经历 50 次传代之后，可能表现就会变差。为了进行合理的比较，应该在小试水平模拟大规模培养过程所需的多级种子，例如在小试发酵罐接种经多级培养的种子。这有助于分析不同规模上的性能差异是由于真正的规模效应，还是仅仅由于菌株传代次数多少所产生的效应。

第四，确保使用可规模化放大的培养基成分。在小试试验中，使用高质量的原料和昂贵的抗生素或诱导剂通常是负担得起的。然而，在大规模生产上，获取这些原料就很有挑战，而且可能负担不起。同样，为了进行比较，在小试最好使用与放大体系中相同的原料。

坚持目标导向有助于从一开始就开发一个可规模化的发酵工艺。由于大型生物反应器的运行成本高昂，因此在使用大型生物反应器之前，至少应该采用小试发酵来降低主要因素的风险。在项目的早期阶段，生产反应器的确切规格可能还不完全了解，但经验丰富的发酵放大工程师可以给出范围，并确保小试工艺是在正确的范围。

最后，尽早并且频繁地与下游工艺 (DSP) 团队合作是很重要的。从某种意义上说，制造一个分子只是生物制造工艺的开始；从最终的产物中提纯分子并将其制成产品也同样重要。菌株工程、发酵和纯化之间的密切合作有助于鉴别技术机遇，使彼此的工作更加轻松!